生物制药厂过氧化氢蒸汽灭菌技术及其验证方案

随着生物制药厂房等高洁净场所对过氧化氢灭菌技术的广泛应用，灭菌过程、验证方法以及关键控制点的确立变得至关重要。因此，评估过氧化氢蒸汽灭菌技术的优劣势成为选择生物制药厂房洁净区灭菌方式时必不可少的关键因素。

生物制药厂房对洁净区的空间灭菌效力要求极高，要满足以下五个主要要求：

简便操作，不会对人员和环境造成危害。

杀菌效力需达到2020年版《药典》规定的灭菌标准，即对枯草芽孢杆菌和嗜热芽孢杆菌达到104～106的致死率。

材料兼容性好，不会对洁净区内的设备、彩钢板、环氧树脂地面、高效送风口、回风口、玻璃等造成破坏。

无残留，即灭菌后的消毒灭菌剂残留不会对药品构成任何形式的污染。

扩散性好，能够扩散至被灭菌环境内的各个方位，不会留有死角。

传统的消毒液擦拭法、紫外灯照射法、甲醛熏蒸灭菌技术、臭氧灭菌等灭菌方法存在可重复性差、难以验证、破坏性大、需消耗大量人力以及危害作业人员身体健康等问题。为解决这些问题，近年来引入了汽化过氧化氢蒸汽灭菌技术。本文将详细介绍过汽化过氧化氢的技术特点与灭菌效果的验证。

一、过氧化氢蒸汽灭菌技术

1.1 技术背景

在当今的制药工业中，过氧化氢已逐渐替代传统的灭菌方法，成为表面和空间消毒以及灭菌的常用方式。过氧化氢由水和氧气组成，这两者都具有高度安全性。然而，由于氢键作用产生的“黏滞分子”，导致过氧化氢蒸汽扩散困难，这可能在灭菌过程中带来一些挑战。由于过氧化氢汽体的扩散性相对较差，可能会对操作的安全性产生一定的影响，因为泄漏的汽体更容易“悬浮”在泄漏地点，如果没有外部作用力，扩散会受到限制。因此，通常需要采用喷射嘴等方法来提供额外的动能以促进汽体的扩散。

1.2 技术特点

安全：整个灭菌过程中限制人员进入，可安全复原。

可靠：能够使密封屏障内空气与表面杀菌对数值达到4～6，简单可靠。

智能化：能与建筑设施一体化，与BMS实现控制一体化，降低操作人员依赖性。

标准化：能与空调系统结合，避免传统灭菌方式难以标准化、验证困难等问题。

1.3 技术方式

通过高温闪蒸将过氧化氢液体转化为气体，然后以高速气流将其喷射到灭菌空间中。在高温饱和的条件下，过氧化氢蒸汽接触到较冷的物体表面时，会发生微冷凝，产生强氧化自由基（羟基），这些自由基可以攻击病原微生物，如细胞膜、脂质、蛋白质和DNA，以快速杀灭微生物，杀灭效果可达log 6。完成灭菌后，汽化过氧化氢设备会自动分解过氧化氢分子为水蒸气和氧气，直到过氧化氢浓度降至1 ppm以下，方可重新进入洁净区。

汽化过氧化氢灭菌有两种方式，即“干法灭菌”和“湿法灭菌”，两者都可以实现log 6的微生物杀灭率。它们的主要区别在于湿度和干燥剂的使用。对于“湿法灭菌”，主要目的是将气体冷凝为微冷凝状态，D值通常为1.08分钟，在整个灭菌过程中无需控制空间湿度和除湿。而“干法灭菌”需要通过降低空间湿度和增加过氧化氢浓度来杀灭微生物，整个过程需要对空间进行除湿，湿度通常需要保持在30%以下。

随着新版GMP的实施和推广，我国对无菌药品生产提出了更高的要求。尤其是在生物制剂迅速发展的背景下，一次性使用系统技术广泛应用，厂房布局更加灵活。空间灭菌一直是生物制药生产中的关键环节，为提高产品质量，选择适当的灭菌方式至关重要。在多种灭菌方式中，大多数公司选择“干法过氧化氢灭菌”，其对生物指示剂嗜热脂肪芽孢杆菌的杀灭率可达log 6，成为抗体、CAR-T、干细胞等生物领域净化的新选择。

1.4 注意事项

在使用过氧化氢进行厂房灭菌时，必须密切监测浓度和时间限制，同时要警惕健康风险，确保操作人员具备必要的安全知识。

暴露浓度和时间限制：

工作暴露浓度不得超过1 ppm，持续时间不可超过8小时。

短期暴露浓度不可超过2 ppm，持续时间不可超过15小时。

危险浓度为75 ppm。

健康风险：

过氧化氢具有亲水性，接触眼睛或喉咙可能导致呼吸困难，甚至休克。

皮肤接触可能导致皮肤氧化，产生白斑，但用水清洗后皮肤会自然恢复。

严重事故报告较少，通常是由于操作人员缺乏了解而导致的。

防漏控制：

过氧化氢的低扩散性可降低人员的潜在危险。

高扩散性气体（如甲醛和二氧化碳）会增加操作人员的潜在危险。

防止蒸汽冷凝同样重要，可减少管路内过氧化氢的损失。

温度在管路内过程中是非常重要的因素。

另外，防漏控制和管路温度管理也是确保安全和有效的灭菌过程的关键要素。

二、消毒设备需要考虑的要素

2.1 消毒效果的衡量评估

制药企业的洁净区级别不同，消毒要求不同。已B级区为例，需采用106的嗜热脂肪杆菌芽孢作为生物挑战菌来评定消毒效果。

2.2 腐蚀性的评估

主要对彩钢板、镀锌板易氧化材料的腐蚀性评价。

2.3 消毒过程衡量和评估

使用过氧化氢蒸汽进行消毒灭菌需要综合考虑处理时间、准备工作、过氧化氢凝聚与扩散以及起泡现象等问题，以确保灭菌过程既有效又安全

处理时间

整个灭菌过程所需时间包括通风排气时间，即达到验证标准中的1 ppm以下过氧化氢浓度标准需要多长时间。这不仅仅是关注消毒持续时间，更需要考虑其他因素。

准备工作

需要考虑是否需要降低环境温度，因为某些企业和设备要求温度在20℃以下。同样，湿度也需要降低，最低的工作湿度要求是多少。这些因素都会增加企业的隐性成本，直接影响停产时间。

过氧化氢凝聚和扩散

在汽化过程中，过氧化氢会凝聚成液体，这个液体是引起腐蚀的主要因素，其严重程度直接取决于凝聚物的量。过氧化氢汽雾可直接观察，这是可见的扩散情况。

起泡现象

在金属表面或薄油漆涂层修复/喷涂表面时，过氧化氢因表面多孔性而吸附，基底物反应后产生的氧气无法迅速扩散出去，可能导致"氧气泡"。例如，生物制药厂房在对洁净空间进行连续多次过氧化氢灭菌时，可能导致彩钢板涂层表面出现"氧气泡"并引发腐蚀。因此，在选择过氧化氢灭菌设备时，需要在数个月内的多次运行后关注以下问题：

是否会对空间内的电子设备造成损害？

电线是否受到损害？

不锈钢是否受到影响？

有涂层的低碳钢是否发生变化？

暴露的印刷电路板是否有损坏？

2.4 过氧化氢蒸汽灭菌实例介绍及验证

现以某企业厂房洁净区汽化过氧化氢灭菌系统及隔离器灌装线为例，简单介绍灭菌过程、关键控制点、验证注意事项及最终验证结果

洁净区汽化过氧化氢灭菌系统验证:

在确认验证方案后，根据房间大小按照既定的配方和剂量制备消毒液，特别要计算过氧化氢溶液的使用量。

确保被消毒的空间表面没有明显的污物，保持表面干燥，避免高温环境。

对验证测试所需的指示剂进行编号和布局，确保它们在测试开始前都在正确的位置。

当设备和指示剂都就位后，用胶带密封可能的泄漏点，确保房间密封。

生物和化学指示剂测试：

进行灭菌效果测试，包括生物指示剂测试 (BI测试) 和灭菌均匀性测试 (CI测试)。

选择最耐受过氧化氢的嗜热芽孢脂肪杆菌(106)作为挑战菌种进行验证。

在灭菌结束后，将生物指示剂放入胰酪大豆胨液体培养基中培养，并观察结果。

阳性对照组应呈黄色，阴性对照组应呈紫色。如果试验组也呈紫色，说明实现了对洁净空间的log 6级灭菌效果。

收集并拍照存档所有指示剂，通过分析化学指示剂判断灭菌过程的均匀性。

对生物指示剂进行7×24小时的培养，以确定灭菌结果。

示例：

在确定好过氧化氢蒸汽灭菌设备位置后，使用胶带密封房间门缝和轧盖出料段处的门缝，确保房间密封。

控制温度在10～40℃，湿度在15%～80%之间，关闭空调后开始验证过程。

最终，通过观察所有监测点的化学指示胶带，发现它们在接触过氧化氢气体后变色。

试验组中接种生物指示剂的TSB培养基未发现细菌生长（未出现浑浊），而阳性对照管出现了细菌生长（浑浊），阴性对照管未发现细菌生长，从而确定了消毒合格。

在体积为190 m3的房间内，最终得到的灭菌条件为过氧化氢用量1140 mL（相当于6000mg/m3），气体注入速率为8000 mg/min，过氧化氢汽体注入速率为4000 mg/min。

结论

过氧化氢蒸汽灭菌技术是生物制药厂房洁净区消毒和灭菌的可行方法之一，具有操作简便、安全可靠、智能化等优势。但在应用前需充分了解其技术特点和注意事项，制定有效验证方案，以确保灭菌效果符合相关法规要求，同时降低人员和环境的风险。

附：法律法规参考

《制药生产质量管理规范》

《制药企业洁净区设计建设及验收规程》

《制药洁净车间消毒技术导则》

《制药洁净区等级划分与验收规程》

《药品生产质量管理规范》

以上内容仅供参考，具体操作需根据企业实际情况和法规要求进行具体制定和执行。

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