微生物实验室中的污染:来源、影响与控制策略

发布时间:2024年01月03日 浏览次数: 250 次

在生物实验室中,污染是一个已经明确存在并会造成严重后果的问题。污染可分为三大类(物理、化学和生物)。最常见的生物污染是细菌、霉菌、酵母菌、病毒、支原体以及其他细胞系的交叉污染。本综述概述了污染物的主要关键来源和控制方案。污染的关键源头是在实验室工作开始到结束期间突然或故意将污染物引入所需的系统。为了克服这一挑战,日常必须采取多种策略,如从信誉良好的基因库中获取纯净、有活力的细胞;定期检查培养物的特性;采用良好的无菌技术;常规使用抗生素等。总之,本文建议在培养物受到感染的几天内对其进行目视检查,从而降低或消除污染的频率和严重程度。

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引言

污染是指在取样、保存、加工、储存、转移、包装和运输过程中,将化学、微生物或物理等杂质带入或带入起始或中间细胞培养物。细胞培养污染物的定义是培养系统中的某些元素,由于可能对系统或其使用产生不利影响而不受欢迎。细胞培养物污染是一些微生物实验室最常遇到的问题,有时会造成非常严重的后果。总的来说,造成污染的原因大多是可避免的程序错误和错误的技术指导。微生物广泛分布于环境中,不受任何限制,甚至在实验室内的不同地方都有它们的身影。对于使用微生物培养物的研究人员来说,微生物污染是最大的世界性障碍之一。它可能会损失实验室中有价值的菌株。假阳性培养物是由于常见或不常见的实验室污染物造成的微生物实验室报告。由于缺乏适当的管理,微生物实验室中会出现高浓度的微生物污染物。这是一个全球关注的健康问题,导致难以获得准确的研究成果。它被人工或系统地引入到我们的培养液中,损害了我们的工作质量。最近,许多文章都提到了这一问题,以前的报告也证明了这一挑战。最后,为了减少污染物,首先要应用良好的实验室实践,其次要遵循适当的说明 [2、6、7 和 12]。

污染物正受到高度关注,但对其来源和过程还不甚了解。本研究的主要方法论部分是在观察性队列研究和工作区(实验室)长年目测调查经验的基础上进行的。当前研究的目的是确定实验室内细菌污染的关键来源,然后回答交叉污染是如何发生的?本文旨在介绍防止微生物、物理或化学交叉污染的适当和必要方案,减少假阳性培养报告,并通过实用技术最大限度地提高微生物实验室的真实结果。

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细胞培养污染的类型

2.1 物理污染物

物理污染物是指作为污染物的天然或人工成分。污染物。它也被称为不需要的异物,如玻璃碎片、金属、石块、塑料、不相干的植物物质、毛发、纤维、移液管、储存设备、仪器、铝箔或纸张残留物以及培养箱中残留的灰尘颗粒。消毒剂或清洁剂残留在培养箱中的铝箔或纸张残留物和灰尘微粒也属于此类。

2.2 化学污染

化学污染是指任何非生物物质的存在都会对培养系统造成不良影响。对培养系统产生不良影响。在任何情况下,它对细胞培养都是无用的,会导致细胞 死亡。它可能会产生毒性。培养基、血清、水中的杂质、金属离子、内毒素、自由基、洗涤剂和细菌。自由基、洗涤剂、杀菌剂或杀虫剂残留物是主要成分。除此之外、二氧化碳培养箱所用气体中的杂质也包括在内。

2.3. 生物污染

生物污染物是有生命的,可细分为细菌、霉菌、酵母菌、病毒、藻类、原生动物等多个分支、病毒、藻类、原生动物、无脊椎动物等,因此容易受到其他细胞系的交叉污染。交叉污染。微生物物种的污染,可通过物理方式(共用培养基和试剂、使用未拔下的电源插头等)传播。共用培养基和试剂、使用未拔下插头的移液管、处理不当和使用未经消毒的试剂、意外溢出或不正常接触培养基 溢出或与无生命物体的非正常接触)和生物途径(直接或间接接触 手)。任何类型的微生物实验室对生物污染都很敏感。因此 因此,空气中的微生物很容易转移、进入和生长出所需的培养细胞。其背后的原因是存在大量微生物,而且没有遵循良好的培养规范。

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污染源

编号潜在污染源
1- 实地采集的样本成分和采样地点。
- 样本量不足和选择错误。
- 样本采集和处理设备不当,如塑料或金属颈管或试管、解剖套件、烧瓶、烧杯、镊子、移液管、冰盒、玻璃器皿和层流气流柜。
2- 过多的内部和外部非生物成分(热、冷、阳光、湿气)。
- 来自实验室水槽、空气、灰尘颗粒、工作台、地板、桌子、房间、水源和培养箱。
3- 虫害,尤其是螨虫。它们会随气流移动。由于螨虫在培养器皿中进进出出,培养物会受到污染。人员可能将昆虫带入实验室(头发、衣服、鞋子上)。
4- 使用保质期缩短的培养基。
- 用于制备培养基的试剂、溶液、化学品和水变质。
- 使用不符合验收规范的材料。器皿校准不当和设备故障。
- 供应品或资源短缺。
5- 在所有单位引进未经授权和不熟练的人员进行样品的采集、鉴定、定性和保存。
- 未受过教育,没有足够的能力执行所要求的特定任务。
6- 标本处理过程中产生的气溶胶或飞溅物和疫情。此外,在运输和培养过程中也会产生气溶胶。
7- 由于人手不足,在一批标本中处理过多标本可能导致无法遵守规程,并可能造成交叉污染的错误
8- 污染物进入工作和库存文化的途径多种多样。特别是,由于以下原因,污染物可能会从我们的皮肤和呼吸系统中逸出:人员清洁不足、皮肤消毒不足、手部卫生差、实验室防护服和个人防护设备(如外科手术用一次性手套和外套)不足,所有这些都被不同的研究人员提及。
9- 细胞培养物、鉴定仪器、电子计算机、手机和其他输入机器的选择、储存和处理不当。
- 生产设施薄弱。
- 地板、墙壁和天花板粗糙。
- 缺乏空气过滤系统。
- 照明和通风不当。
- 通风口、窗台和排水沟位置不佳。
- 清洗、清洁、厕所和储物柜设施不足,无法保证操作卫生。
10- 使用和处置用于解剖和切割碎玻璃、针头或刀片的锋利工具。
- 化学和高温灼伤或火灾。
11- 标签错误、沟通不畅、因工作繁忙而过度劳累。
- 注意力不集中可能是紧张或混乱、糠麸和健康心理障碍。
- 吃东西、喝饮料或使用违禁药物等不良行为。
12- 二氧化碳培养箱所用气体中的杂质。
13- 错误的研究设计、实验设置和培养方案。
- 脱离科学依据的调查和跟踪。
- 为实验室试验花费不必要的时间和精力。

污染控制策略

编号污染控制策略
1- 遵守设施的书面政策。
- 不要将化学品倒入下水道。
- 应在一天的结束和开始时进行清洁和去污。
2- 采用灭菌方法,如 121°C 高温高压灭菌 20 分钟、160°C 热风炉 1 小时、微滤或超滤、焚化炉、紫外线、火焰、福尔马林和乙醇。
- 使用无菌设备和环境有助于防止给定样本受到进一步污染。即使是用无菌铝箔覆盖的材料也对研究成果的质量起着至关重要的作用。
3- 维护实验室环境。首先,暴露在外进行熏蒸。其次,继续进行空气采样以进行微生物评估。第三,调整实验室的所有物理因素(实现房间通风系统,在空气过滤路径中置换新鲜空气);第四,不受人为因素的影响和干扰,最终减少事故发生的机会。
4- 确保培养基瓶和烧瓶干燥,并用 70% 的酒精或 5% 的次氯酸钠擦拭,然后才能用于 进一步制备和放入罩中。
- 避免将装有(培养基、溶液等)的瓶子长时间打开,用完后立即关闭。
5- 正确安装、包装和处理仪器
- 检查项目的验证日期。
6- 在采集和处理样品时,应在无菌条件下小心工作。
- 用消毒剂清洁工作区,准备一个安全无菌的工作区:
· 标本和小袋应逐个处理。
· 样品去污
· 每次只处理一个细胞系。
7- 减少细胞培养事故发生的机会,主要可能的解决方案包括:用彩色墨水清晰标注分配任务、书面程序、良好监督、分配任务、精心计划和备份
8- 跟进接种和其他无菌程序。
- 无菌转移培养物和无菌溶液。
- 制备供研究使用的接种剂和培养物。
- 短期和长期使用库存培养物,并将其保存在适当的温度下,以及在重新使用前对库存培养物进行无菌测试。
- 每次只使用一种细胞系,以有效防止交叉感染。
- 不要将饲养培养物长时间放在实验室工作台上。
- 必须密封培养容器。如果正在发生虫害问题,可使用杀虫剂、石膏和塑料盒进行防治。通常使用塑料薄膜包裹培养皿。
- 定期对存活细胞进行观察筛选,并定期检查细胞系的特征,以确定是否存在污染。所有类型的新细胞在进入实验室时、细胞解冻前和解冻后都要进行筛查,重要的是要在论文发表前筛选出不需要的可疑细胞。
- 使用多种技术对混合和受污染的细菌培养物进行额外的亚培养,或丢弃受污染的培养物。
9- 正确的移液技术可确保吸液和分液的体积准确,避免分液时液体飞溅。
- 尽可能将反应和成分盖上盖子
10- 使用具有选择性和保质期的培养基进行制备和后续工作。
- 切勿将培养基和生物体存放在有光照的冷库中。
- 在培养基中添加生长抑制物质
11- 气溶胶会导致样品间的交叉污染。
- 抗气溶胶移液器吸头有一个屏障,当吸头接触到潜在的液体污染物时起到密封作用,将其阻隔在屏障内。
12- 对人员进行相关特定目标的净化规程培训。
- 为每节实验课提供额外时间,并在实验室内花大量时间保护自己。
- 始终穿戴个人防护设备。穿全袖大衣,将大衣放在培养室内,并在经过至少 30 分钟的紫外线浴后才穿上。
- 人员和材料的单向工作流程。
13- 保持工作表面和材料整洁有序。
- 避免杂乱无章。
- 尽可能使用小容器
- 活动结束后,将试剂和其他物品放回原处。
- 应定期清理设施。包括地面、天花板和墙壁。
- 定期清空垃圾桶
- 立即清理任何溢出物。溢出物应始终按照正确的处理程序对该区域进行消毒
- 使用完所有不必要的设备后,将其移走并进行消毒,然后妥善存放
- 在工作之前、期间和之后检查表面和工具。
- 在日志中记录每个设备的清洁状况
14- 在采集、运输、隔离、鉴定和描述样本时,始终戴无菌手套。
- 经常更换手套,尤其是在对每个样本进行 DNA 和 RNA 扩增时。
- 基本上,尽量不戴手套处理任何东西。
15- 微生物实验室的设置是专门为科学实验而设计的。每个细胞培养都有书面实验记录。
16- 使用标准外科口罩,以保护呼吸道口腔飞沫的直接接触。
- 准备标本时应避免接触口罩。
- 不要在培养室内交谈。如果需要,请使用口罩。您的口腔中有真菌,可能是感染源。
可能是源头。
17- 在处理细胞时,用适当稀释的酒精(70%)喷洒双手,直至手肘。
- 进出实验室前用消毒肥皂和温水彻底洗手。从个人手部卫生开始控制各类污染,并贯穿培养的所有步骤。
18- 避免在同一培养箱中同时培养动物细胞、人体细胞和微生物细胞。
- 使用推荐的溶液清洁培养箱。可每天、每周或每月清洗一次。
19- 配备房间通风系统,更换空气过滤通道中的新鲜空气。
- 空气过滤和换气率的设置应确保达到规定的洁净室等级。
- 关键区域的气流应为单向气流(层流),其速度应足以将微粒从填充 / 关闭区域扫除。
- 空气处理管道应进行清洁和适当维护,并应经常更换排入培养室空气的预过滤器。
20- 进入橱柜时,用 70% 的乙醇擦拭表面。
- 使用前,让罩内的空气流通 5 分钟。这将使任何污染物有望进入层流,而不会最终进入培养基或培养皿。
- 用于进行病毒或细菌培养的仪器不得用于标本制备或装袋。
- 将封闭的样本和处理用品放入通风橱中,在紫外线灯下照射 15 分钟
- 样品处理完成后,用 70% 乙醇再次擦拭表面
- 关闭紫外线防护罩,紫外线灯自动开启 15 分钟层流气流罩:
1. 注意
- 不使用时保持箱体完全关闭;始终戴手套;在箱体内至少 6 英寸处工作;头部远离箱体;
2. 不要
- 快速移动导致柜内产生大量湍流;在机罩内存放任何物品,因为这些物品可能会阻挡无菌气流并影响无菌性;对着机罩方向打喷嚏或咳嗽;在打开 UV 和机柜的情况下操作机罩;避免快速进出机罩。

污染物对细胞 / 微生物培养及其他的影响

  • 争夺养分,阻碍细胞生长和增殖。
  • 使细胞分别接触到不需要的初级和次级代谢物的利用和产生。
  • 从数量和质量上改变蛋白质、RNA 或 DNA 的合成水平。
  • 改变基因表达、细胞信号、形态和生理机能。
  • 在高层次上破坏细胞膜和细胞器。
  • 导致突变和染色体变化。
  • 破坏自然微生物群落结构和功能。
  • 破坏培养物的生长和特性。对抑制细胞新陈代谢产生不利影响。
  • 破坏有价值的产品,使培养物失去纯度和活力。
  • 对技术人员、研究人员、医护人员和病人造成多种实验室感染风险 / 爆发。免疫缺陷者对严重的人类疾病非常敏感。传播方式的持久性病原体数量巨大。
  • 影响信号转导。
  • 成为公共卫生问题,可用于生物武器。
  • 造成严重的经济挑战。
  • 研究成果质量下降,实验结果不准确或有错误记录。
  • 损失时间、金钱(细胞、培养皿、培养基和血清)和精力(用于培养和建立实验)已经发生

总之,有三种最佳做法可以保持细胞培养物的完整性和准确性,并促进安全的实验环境。首先,使用适当的实验室设计。第二,使用正确的培养程序。第三,使用合适的清洁程序。这是成功完成实验的最佳操作。

污染物的未来发展方向

实验室需要有调查审查程序,以确定异常数量的假阳性培养物,并建立一种机制来 深入确定可能的原因。至少必须每月或每年进行一次随访。临床医生、实验室技术人员和研究人员之间的持续沟通对于解释交叉感染和自身感染导致的异常结果仍然至关重要。今后,我们将重点支持三项活动。即:(I). 通过各种公认的科学方法(如代谢和遗传指纹图谱)鉴定类群。

(II). 根据指示微生物的分离和鉴定,确定潜在危害的来源、

(III). 开发处理微生物危害的方法。当开始探索污染物时,将有望取得进一步的成果,如抗生素生产、医疗价值、生物技术研究和抗菌活性的耐药性和敏感性检测。未来,通过持续的研究产生全面的科学知识非常重要,甚至可以在微生物多样性(群落、功能和结构)模式领域进行调查。我们将在该领域开展更多的系统研究,以消除令人沮丧和破坏性的想法:完成独特的工作,并获得合适的有活力的纯培养物。其优点将大于缺点。

结论

总体而言,本研究报告指出,实验室设备和环境是潜在的污染源,其浓度很高。要解决这个问题,必须采用各种方法。如今,定期制定、实施和重新验证规程是最可接受和最经济实惠的选择。建立控制点对所有人都至关重要。从采集样本到处理样本,每一步都要考虑到关键点,采取适当而谨慎的管理策略,可以大大降低污染负荷。最后,本文得出结论,污染物会造成研究工作的损失,并干扰中心细胞教条的正常安排或功能。因此,本文有助于解决微生物实验室中污染物的短期和长期影响问题。总之,污染是可以完全消除的,但可以通过引入良好的实验室操作规范来降低其发生频率和后果的严重性。

建议

应经常对物理、化学和微生物组合进行季节性调查和持续监测,以保持培养物的纯度。基于实际情况的后续控制机制应能消除交叉污染的风险。

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