消毒剂效力验证的实用指南与常见问题解决

发布时间:2024年01月24日 浏览次数: 192 次

消毒剂的习惯定义:能消除以细胞繁殖形态出现的微生物污染的化学物质。

消毒剂的分类定义(USP29 <1072>):

① 抗菌剂(Antiseptic)

② 化学杀菌剂 (Chemical Disinfectant)

③ 清洁剂 (Cleaning Agent)

④ 消毒剂 (Disinfectant)

⑤ 卫生洗涤剂 (Sanitizing Agent)

⑥ 杀孢子剂 (Sporicidal Agent)

⑦ 灭菌剂 (Sterilant Agent)

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一、消毒剂配制及其注意事项

  • 按供应商的使用说明进行配制和储存 (纯化水、注射用水)
  • 洁净室及相关受控环境使用,应进行除菌过滤。
  • 温度提高,杀菌效力增大。效力验证时,在常温下配制。

二、影响消毒剂效力的因素

pH;温度,浓度;材质和附着物质;溶剂(水);接触时间;微生物的类型和数量;

三、消毒剂作用机理

  • 钝化胞内酶活性,影响细胞的正常代谢(如酚类)
  • 阻断物质运输通道(如季铵盐类(+ 电荷),附着于细胞膜特定部分(- 电荷)
  • 破坏微生物细胞(膜)的结构和功能(如醛类、含氯、过氧化物)
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四、微生物对消毒剂的耐受性受以下几方面因素的影响

  • 形成生物膜(粘性多糖物质)
  • 消毒剂的相互作用(中和反应)
  • 固有耐受性和概率残存
  • 致死剂量

五、微生物抗力由小到大排列

一般为细菌繁殖体 -- 真菌繁殖体 -- 真菌孢子 -- 病毒 -- 分枝杆菌 -- 细菌芽孢

六、消毒剂的选择考虑如下因素

  • 需控制的微生物的类型和数量
  • 市售消毒剂的抗菌谱
  • 消毒剂的品牌
  • 浓度、使用方法和接触时间
  • 待消毒物体的材质和对消毒剂的兼容性
  • 可能影响杀菌效力的表面有机物数量
  • 反复使用,对设备表面的腐蚀程度
  • 对操作者的安全性
  • 和清洁剂 / 其它消毒剂的相容性
  • 交替使用方案和对产品的影响

七、消毒剂验证步骤

第一步:在实验室对代表细菌在规定的使用浓度和规定的作用时间进行确认。

第二步:应用不同材质的载体,进行模拟试验

第三步:完成验证报告,形成 SOP。

八、验证用菌种

金黄色葡萄球菌、铜绿色假单胞菌、沙门氏菌、大肠埃希菌、枯草杆菌、白色念珠菌、黑曲霉、环境分离菌。

菌种选择的原则:代表性,普遍性,标准菌种。(环境中常见的污染菌)。菌种的要求:不得超过 5 代。

采用适宜的方法保存。

九、挑战微生物 (USP29)

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十、准备性试验

选择适合的中和剂:Letheen 肉汤、D/E 中和肉汤(酚类,季铵盐类)、TAT 肉汤基础 + 吐温 20 + 卵磷脂 + 胰蛋白胨

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10.1. D/E 中和肉汤配方(每升)

胰蛋白胨 5g;酵母膏 2.5g;葡萄糖 10g;硫乙醇酸钠 1g;硫代硫酸钠 6g;亚硫酸氢钠 2.5g;吐温 805g;卵磷脂 7g;溴甲酚紫 0.02g;最终 pH7.6±0.2 于 25℃;

10.2. 准备性试验之中和剂毒性

将 10 ~ 100CFU 的微生物加入到中和剂中;薄膜过滤,冲洗,培养,计数¢与菌液对照组比较,回收率应 >70%

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10.3. 准备性试验之中和效力

使用中稀释检测(use-dilutiontests)(对不同浓度下,对消毒剂的效力进行筛选;针对不同标准菌株和环境微生物,确认接触时间)

  • 将消毒剂和中和剂混合(记录时间)
  • 加入 10 ~ 100CFU 微生物¢薄膜过滤,冲洗,培养,计数
  • 与菌液对照组比较,回收率应 >70% 验证方法

薄膜过滤法:菌悬液和消毒剂直接混合,在不同的时间间隔条件下过滤,培养后评价。

十一、验证准备

测试菌液准备:增菌过夜,并调整至 106 ~ 108CFU/ml

消毒剂稀释至规定浓度:分装 10ml 于若干无菌试管中;试管上标注消毒时间:如“1 分钟组”,“5 分钟组”,“10 分钟组”或其他要求的时间段。

配制中和剂(分装 100ml,300ml)验证步骤:

接种:接种各验证菌种至盛有待验证消毒剂的试管(使接后浓度 >104CFU/ml),混合均匀,并立即开始计时。

中和、过滤:将消毒剂倾入 100ml 中和剂中,混合,稀释(如需要),过滤,然后用 100ml 中和剂清洗滤膜,滤过 3 次。

阳性对照:用无菌水代替消毒剂,步骤同上。

培养和计数:取下滤膜放入规定的培养基平板,在规定的温度、时间培养后,记数。和阳性对照相比,微生物数量下降应至少 3 个对数值(细菌芽孢至少 2 个对数值)。

表面挑战试验(surfacechallengetests)

  • 使用标准菌株和典型环境分离微生物
  • 选择合适的浓度和接触时间,进行试验
  • 获得挑战微生物数量下降的对数值
  • 对使用新消毒剂前后环境微生物的检出频率和数量进行统计学评估(无菌生产区域、GMP 要求)
  • 根据设施的实际情况,选择不同材质的载体(玻璃,不锈钢,塑料薄膜,乳胶,墙面涂料,地面材质)
  • 接种,并确认实际数量
  • 接触杀菌、中和、过滤。

十二、正确使用消毒剂

  • 稀释消毒剂时应用纯化水、注射用水
  • 设备使用后彻底清洁
  • 将环境常见菌列入验证范畴
  • 轮换使用不同的消毒剂,消毒剂间要用无菌水充分清洗
  • 消毒的 SOP:配制、使用、纠正、防护等
  • 供应商的审核和确认

十三、消毒剂的文件

  • 标准操作规程 SOP
  • 消毒剂配制记录
  • 消毒剂使用记录
  • 消毒剂标签消毒剂文件,应该等同于原始记录。

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