消毒剂效力验证的实用指南与常见问题解决

消毒剂的习惯定义：能消除以细胞繁殖形态出现的微生物污染的化学物质。

消毒剂的分类定义（USP29<1072>）：

①抗菌剂（Antiseptic)

②化学杀菌剂(Chemical Disinfectant)

③清洁剂(Cleaning Agent)

④消毒剂(Disinfectant)

⑤卫生洗涤剂(Sanitizing Agent)

⑥杀孢子剂(Sporicidal Agent)

⑦灭菌剂(Sterilant Agent)

一、消毒剂配制及其注意事项

按供应商的使用说明进行配制和储存(纯化水、注射用水）

洁净室及相关受控环境使用，应进行除菌过滤。

温度提高，杀菌效力增大。效力验证时，在常温下配制。

二、影响消毒剂效力的因素

pH；温度，浓度；材质和附着物质；溶剂（水）；接触时间；微生物的类型和数量；

三、消毒剂作用机理

钝化胞内酶活性，影响细胞的正常代谢（如酚类）

阻断物质运输通道（如季铵盐类（+电荷），附着于细胞膜特定部分（-电荷）

破坏微生物细胞（膜）的结构和功能（如醛类、含氯、过氧化物）

四、微生物对消毒剂的耐受性受以下几方面因素的影响

形成生物膜（粘性多糖物质）

消毒剂的相互作用（中和反应）

固有耐受性和概率残存

致死剂量

五、微生物抗力由小到大排列

一般为细菌繁殖体--真菌繁殖体--真菌孢子--病毒--分枝杆菌--细菌芽孢

六、消毒剂的选择考虑如下因素

需控制的微生物的类型和数量

市售消毒剂的抗菌谱

消毒剂的品牌

浓度、使用方法和接触时间

待消毒物体的材质和对消毒剂的兼容性

可能影响杀菌效力的表面有机物数量

反复使用，对设备表面的腐蚀程度

对操作者的安全性

和清洁剂/其它消毒剂的相容性

交替使用方案和对产品的影响

七、消毒剂验证步骤

第一步：在实验室对代表细菌在规定的使用浓度和规定的作用时间进行确认。

第二步：应用不同材质的载体，进行模拟试验

第三步：完成验证报告，形成SOP。

八、验证用菌种

金黄色葡萄球菌、铜绿色假单胞菌、沙门氏菌、大肠埃希菌、枯草杆菌、白色念珠菌、黑曲霉、环境分离菌。

菌种选择的原则：代表性，普遍性，标准菌种。(环境中常见的污染菌）。菌种的要求：不得超过5代。

采用适宜的方法保存。

九、挑战微生物(USP29)

十、准备性试验

选择适合的中和剂：Letheen肉汤、D/E中和肉汤（酚类，季铵盐类）、TAT肉汤基础+吐温20+卵磷脂+胰蛋白胨

10.1.D/E中和肉汤配方（每升）

胰蛋白胨5g；酵母膏2.5g；葡萄糖10g；硫乙醇酸钠1g；硫代硫酸钠6g；亚硫酸氢钠2.5g；吐温805g；卵磷脂7g；溴甲酚紫0.02g；最终pH7.6±0.2于25℃；

10.2.准备性试验之中和剂毒性

将10～100CFU的微生物加入到中和剂中；薄膜过滤，冲洗，培养，计数￠与菌液对照组比较，回收率应>70%

10.3.准备性试验之中和效力

使用中稀释检测（use-dilutiontests)(对不同浓度下，对消毒剂的效力进行筛选；针对不同标准菌株和环境微生物，确认接触时间）

将消毒剂和中和剂混合（记录时间）

加入10～100CFU微生物￠薄膜过滤，冲洗，培养，计数

与菌液对照组比较，回收率应>70%验证方法

薄膜过滤法：菌悬液和消毒剂直接混合，在不同的时间间隔条件下过滤，培养后评价。

十一、验证准备

测试菌液准备：增菌过夜，并调整至106～108CFU/ml

消毒剂稀释至规定浓度：分装10ml于若干无菌试管中；试管上标注消毒时间：如“1分钟组”，“5分钟组”，“10分钟组”或其他要求的时间段。

配制中和剂（分装100ml，300ml）验证步骤：

接种：接种各验证菌种至盛有待验证消毒剂的试管（使接后浓度>104CFU/ml)，混合均匀，并立即开始计时。

中和、过滤：将消毒剂倾入100ml中和剂中，混合，稀释（如需要），过滤，然后用100ml中和剂清洗滤膜，滤过3次。

阳性对照：用无菌水代替消毒剂，步骤同上。

培养和计数：取下滤膜放入规定的培养基平板，在规定的温度、时间培养后，记数。和阳性对照相比，微生物数量下降应至少3个对数值（细菌芽孢至少2个对数值）。

表面挑战试验（surfacechallengetests)

使用标准菌株和典型环境分离微生物

选择合适的浓度和接触时间，进行试验

获得挑战微生物数量下降的对数值

对使用新消毒剂前后环境微生物的检出频率和数量进行统计学评估（无菌生产区域、GMP要求）

根据设施的实际情况，选择不同材质的载体（玻璃，不锈钢，塑料薄膜，乳胶，墙面涂料，地面材质）

接种，并确认实际数量

接触杀菌、中和、过滤。

十二、正确使用消毒剂

稀释消毒剂时应用纯化水、注射用水

设备使用后彻底清洁

将环境常见菌列入验证范畴

轮换使用不同的消毒剂，消毒剂间要用无菌水充分清洗

消毒的SOP：配制、使用、纠正、防护等

供应商的审核和确认

十三、消毒剂的文件

标准操作规程SOP

消毒剂配制记录

消毒剂使用记录

消毒剂标签消毒剂文件，应该等同于原始记录。

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