干雾过氧化氢（DHP）对结核分枝杆菌的功效，3 级生物安全实验室的例行净化

结核分枝杆菌是全球发病和死亡的主要原因之一，由于耐多药菌株的发展，结核分枝杆菌正变得越来越令人担忧。结核分枝杆菌会污染房间、医疗设备和研究实验室，而且对净化具有很强的抵抗力。

本研究旨在评估在生物安全三级实验室中使用过氧化氢干雾（DHP）对房间进行结核分枝杆菌消毒的效果。生物指示剂（BIs）是预先灭菌的棉质组织，上面含有约107 CFU/ml的结核分枝杆菌H37Ra。使用灭菌器设备为“美卓牌DHP消毒机”，使用7.5%的过氧化氢（舒博牌SP-007杀孢子剂），共进行了三次实验。结果显示，DHP在25分钟内存活细菌的减少超过5 log10，且所有生物指示剂均未出现任何菌落。总的来说，DHP有望成为甲醛的有效而安全的替代品。

DF-10A-杭州美卓生物科技有限公司

美卓生物干雾过氧化氢消毒机DF-10A详细介绍资料。

结核分枝杆菌主要通过气溶胶传播，因此容易污染医疗机构或实验室的房间。此外，这些细菌对消毒和熏蒸过程具有极强的内在抵抗力，并拥有有效的氧化应激防御机制。它们对消毒剂的抵抗被认为介于其他细菌和芽孢之间，且导致这种高抗性的细胞壁成分尚不清楚，但霉菌醇酸和阿拉伯半乳聚糖似乎都与之有关。

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美卓DF-10A

化学液体和蒸汽是常用的去污剂。传统的熏蒸方法包括使用甲醛或环氧乙烷气体，但由于其毒性和致癌性，这些方法已经被淘汰。2004年6月，国际癌症研究机构（IARC）将甲醛列为人类致癌物。法国自2006年9月建议不再将甲醛用于房间净化，并于2007年1月停止生产。过氧化氢因其对各种微生物的生物效果和安全性而成为甲醛的替代品。

过氧化氢已被推荐用于多种材料的消毒，包括牙科器械和支气管镜。过氧化氢蒸汽（VHP）在生物安全柜（BSC）、卫生保健设施、救护车、制药设施和实验室的生物净化中得到越来越广泛的应用。一些研究重点关注其在生物安全三级实验室（BSL3）中对结核分枝杆菌或其他非结核分枝杆菌（NTM）的消毒效果。

在这项研究中，使用“美卓牌DHP消毒机”测试了过氧化氢（DHP）干雾，作为BSL3空气和表面净化的消毒剂。研究目的是评估DHP扩散对清除实验室菌株M.tuberculosis H37Ra（一种无毒菌株）的效果。

材料和方法

生物指标（BIs）的准备

根据法国规范化协会的AFNOR 72-281和AFNOR 72-190标准进行检测，适用于生长缓慢的分枝杆菌。M.tuberculosis H37Ra（ATCC 25177）在Löwenstein Jensen培养基（Bio-Rad）中进行亚培养。亚培养15天后，使用灭菌蒸馏水制备细菌悬浮液，并将其调整为1 McFarland标准。每次实验在Löwenstein Jensen培养基上进行菌落计数，将100μl的悬浮液涂抹在风干的11张预先灭菌的棉质组织（4.5×3厘米）的中央。

BSL3实验室操作

试验在80米³的BSL3实验室中进行，包括两个二级生物安全柜（Securiplus M5142；Astec Microflow，英国）、冷冻箱和培养箱。实验共进行了三个周期。每个周期中，将BI从玻璃管中取出，并放置在实验室的九个位置（A至I）：两个在运行中的生物安全柜中（前面板打开20厘米；平均流速0.45 m³/s），两个在不同的培养箱中（一个封闭，一个通风），五个在天花板上（在实验室中间和角落，一个在DHP仪器后面）（图1）。BI与仪器的距离各不相同（1至9.5米）。为验证在BIs上培养和计数细菌的方法，并确保Mycobacteria细胞在这些处理后仍然存活，我们将两个BIs用作对照，并在样品接触DHP的整个过程中一直保持在BSL3之外。房间内的供暖、通风和空调系统被关闭，以防止DHP在接触期间发生意外扩散或稀释。在接触DHP两小时后，系统恢复。开始扩散前测量的室温为20至23°C，相对湿度为45至50%。DHP消毒是通过使用7.5%浓度的过氧化氢消毒液（舒博牌SP-007杀孢子剂）的美卓仪器进行的，整个过程在25分钟内产生了100ppm的H2O2。

BSL3的示意图，包括每个BI的位置

BIs的培养和计数

将经DHP暴露并在曝气阶段结束后一夜移出房间的9只BI和未经DHP暴露的2只BI（对照组），转移到装有10毫升灭菌蒸馏水的塑料管中。在3分钟内进行超声波处理（2 W；频率20 KHz）（美卓）。对回收的10毫升进行稀释（10-2）处理，使用灭菌蒸馏水。随后，用0.45-μm过滤器（密理博公司，马萨诸塞州贝德福德）过滤每种悬浮液（纯的和10-2稀释的），每种2毫升。过滤器用50毫升灭菌蒸馏水冲洗三次，然后放入添加了OADC（批号5188292；Becton Dickinson，Sparks，MD）的Middlebrook 7H11平板上。所有计数均按照相同的标准进行。CFU在37°C培养4周后进行计数。超声波处理后，将所有BI培养在Middlebrook 7H9肉汤（参考号271310，批号1298006；Becton Dickinson，Sparks，MD）中，以确保该技术能够有效收集所有分枝杆菌，并且支架上没有存活的分枝杆菌残留。

结果

表1列出了三次DHP扩散暴露的结果。在Löwenstein Jensen培养基上，运行1、2和3的初始悬浮液计数分别为106、108和107CFU/ml。

样本、地点运行1运行2运行3

细菌计数（CFU/毫升）增长细菌计数（CFU/毫升）增长细菌计数（CFU/毫升）增长

未暴露对照1 5×105是5×106是5×105是

未暴露的对照组2 5×105是5×106是5×106是

A,运行中的BSC 1 0没有0没有0没有

B，运行中的BSC 2 0没有0没有0没有

C，在VHP机器后面0没有0没有0没有

D，距仪器9.5米0没有0没有0没有

E，出口门上0没有50没有0没有

F，距离仪器5米0没有0没有0没有

G，上述仪器0没有0没有0没有

H，在培养箱中0没有50没有0没有

I，在孵化器中0没有0没有0没有

表1使用DHP后每毫升细菌总数a

BIs培养和计数

我们在Lowenstein Jensen培养基上对所有初始悬浮液进行了菌落计数，以评估应用于BIs的M.tuberculosis H37Ra的数量。我们将这些初始值视为理论初始浓度。在三项检测中，初始接种物值介于106和108 CFU/ml之间。尽管采取了所有可能的预防措施，并使用McFarland标准进行测量，但这一差异凸显出很难获得均匀的分枝杆菌悬浮液。考虑到超声波对分枝杆菌细胞分离的效果，以及分枝杆菌细胞在BI上干燥24小时后存活率可能降低，未暴露于DHP的BI所获得的细菌数被视为实际浓度。未暴露的BI中的细菌数量在5×105到5×106 CFU/ml之间（取决于初始接种量）。在所有实验中，我们观察到大约1-log10的下降，但在所有情况下，我们从对照组中获得了至少5×105 CFU/ml，这使我们能够注意到其他BIs有5-log10的下降。

在第一轮实验中，观察到在37°C下暴露于DHP 6周后的样品比初始接种量减少了超过5个对数值10（在7H11平板上的过滤器上没有菌落生长）。在37°C下培养6周后，在7H9肉汤中亚培养的棉花组织没有生长。这证实了超声波技术能有效地将有活力的分枝杆菌从BIs中分离出来，DHP是一种有效的去污工具。

在第二轮实验中，观察到了相同的结果，但有两个例外。一些Mycobacteria细胞留在了BI E上（生长了一个菌落，相当于50 CFU/ml）。这可以用BI和仪器之间的距离以及两个元件之间的障碍物数量来解释。BI H上也长出了一个菌落，但与最初的悬浮液相比，数量大大减少（50 CFU/ml对107 CFU/ml）。这令人不安，因为这可能意味着DHP进入了培养箱，从而改变了培养箱中的培养物。然而，在37°C温度下培养6周后，在7H9肉汤中亚培养的棉花组织没有生长。

在第三轮实验中，暴露于二甲基亚砜的样品在37°C温度下培养6周后，其菌落数下降了5 log10以上，而且没有一种生物活性成分在移栽培养物中产生菌落。

在三项检测中，我们发现比初始接种量减少了5 log10以上。这些结果表明，DHP在室内的扩散是有效的，而且短时间（25分钟）的暴露足以使BI失活。

结论

生物净化所面临的挑战是找到一种能够触及各处感染性微粒的产品。DHP扩散似乎是甲醛熏蒸的一个很好的替代品，特别是在BSL3级净化中。根据AFNOR 72-281和72-190标准，至少要使初始接种体减少5-log10，才能确定去污剂是否有效。对Mycobacteria抗氧化能力的体外研究结果表明，低浓度的H2O2（10-100ppm）就可以有效杀死细菌。因此，本报告中描述的DHP扩散系统使用7.5%H2O2（舒博牌SP-007杀孢子剂）溶液产生干雾，并将室内干雾维持在80-100ppm。

在我们的研究中，我们使用的是美卓干雾消毒设备，它可以实现DHP。如前所述，结核杆菌具有很强的污染性，因为它能够形成气溶胶，然后在环境中广泛弥散到所有物体表面。使用酒精擦拭布和喷雾剂进行人工消毒只能处理容易接触到的区域。DHP扩散工艺是一种有用的工具，因为它的干雾中含有H2O2，这些带电粒子的尺寸非常小（直径约为10μm），可以作为干气溶胶在空气中自由流通。因此，DHP扩散剂适合用于消除BSL3的污染。在本文介绍的研究结果中，我们在三项独立的试验中证明了这一过程对M.tuberculosis H37Ra的高效性，在无需人工干预的自动模式下，熏蒸周期仅为25分钟。在这些条件下，DHP扩散法能有效杀死结核杆菌。

这证明了VHP处理是消除M.tuberculosis H37Rv室内污染的有效手段。接触DHP后，没有发现任何表面或材料损坏。我们的研究提出的一个问题是，H2O2雾是否会渗入培养箱。我们的研究有效地表明，所有BI（包括培养箱中的BI）上的CFU都减少了。如果在BSL3中发生污染事故，所有培养物都无法转移到其他培养箱中，而且如果H2O2雾渗透到培养箱中，分枝杆菌细胞可能会发生变化。为了证实这一观察结果，还必须进行更多的实验。

总之，我们的研究表明，美卓的DHP可有效净化BSL3中的结核杆菌。为了避免使用致癌物质甲醛，DHP扩散技术是一种很有前途的房间和研究实验室（如BSL3）净化方法。然而，我们只测试了一种M.tuberculosis菌株（H37Ra），它与毒性菌株H37Rv具有相同的特征，包括对抗生素的敏感性。这是我们研究的主要局限性。实际上，在BSL3中可以培养出大量的分枝杆菌菌株，包括耐多药菌株。一些研究发现，一些非结核分枝杆菌对消毒剂的耐药性强于结核分枝杆菌。即使对免疫力较高的实验室工作人员来说，非结核分枝杆菌的危险性较低，但对其他Mycobacteria或非结核分枝杆菌（例如，经常从临床标本中分离出的复合分枝杆菌或脓肿分枝杆菌菌株）进行评估也是很有意义的。